↓100%EtOH 3hr 貼り付けたいです…。 どうぞ宜しくお願い致します。, お世話になります  GFPマウスからの組織をPAS染色したいと思っていますが、パラフィンや新鮮凍結ではGFPが流れてしまうことが多いので灌流固定後、4%PFAそしてシュクロースそしてOCTコンパウンドにてブロックを作っているのですがその切片を切った後のPAS染色を行いたいのですがどのような手順を行えばよいかご教授いただきたく思います。(われわれの研究室は小さくこのような手順を行った方がいらっしゃらないので質問させていただきます よろしくお願いします), マウス胎仔脳の新鮮凍結切片を用いて免疫染色を行っています。後固定に4%PFAをもちいてますが、かなりの確率で脳組織が脱落してしまいます。 mixiユーザー mixiユーザー ちなみに、 組織内にできた泡は、おそらく組織中に余分にある水分が凍結時に凍って氷の結晶を作り、その後、染色時に氷がなくなってできた泡だと思われます。 スライドガラスはAPSコーティングのガラスを使用しています。脳組織の脱落を防ぐ良い知恵をお借りできないでしょうか?, 免疫組織化学の教科書に、PFAで固定後の標本はglycineでアルデヒドをquenchingして、1次抗体と反応させるべきとの記述がありました。 できるだけ良質なゲノムDNAを抽出したいので、どなたかプロトコル、書籍・論文等の参考文献、経験上のアドバイス・注意点などを教えて頂けると助かります。 切片を切る段階でパラフィンに筋が入ったり、クチャクチャになったりするし、上手く切れてもスライドガラスに貼る段階でシワが入ったり組織がはがれたり、乾くと切片がバラバラになったりします。 特に脳などは柔らかく、上手く切れないかもしれませんが、頑張ってください。, ご回答ありがとうございました。milik_teaさんがおっしゃるとおり、サンプルを生で切る方法もあるそうですね。また今後、このようなトラブルが続く場合、検討してみようと思います。, 多分ですね。切片が溶けてスライドガラスにくっつく時に、切片とガラスの間に、空気が追い出されず残ってしまい、泡になっていると思われます。 ↓パラフィン包埋 mixiユーザー 改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。 12月15日 20:28, [12] 胚生10.5-11.5の矢状切片です。4%PFA/PBSで4℃ o/nで固定しています。 ・薄切りすると、表皮を境に裂けます。一応、これをスライドガラスに付け観察するとちゃんと皮膚がいるのですが高確率でねじれたりしてなかなか綺麗な切片を作れません 他の組織のパラフィン切片を作成している同級生は、同じミクロトームでサクサクと切片作成をしています。 ・マウスには皮筋という物が存在していると聞いており、確かに真皮の下のあたりにフィラメント状の構造を確認したのですがこれが皮筋ですか? アドバイスお願いします。, 凍結切片を作製する場合、包埋時に固定や置換をする必要はないと思います。(染色時に固定する。) 11月16日 23:37, [7] mixiユーザー ↓90%EtOH 3hr 凍結切片の作製ですが、自分は30%スクロースでクリオプロテクションを行っています。, 個人的には、まずショ糖に入れてる時間を長くしてみたらどうかなと思います。かおなしさんの記載にあるように、沈むまで、がミソかと。, > ここではOCT compoundへスクロースをもちこんでしまい、OCTと組織間の結合(?)とういか接着(?)が弱くなってしまい、切っている最中に組織とOCTがはずれるという現象がよくおこります。必ず脳のまわりのスクロースをキムワイプなどでとれるだけとり、OCT(クリオモールドにOCTはあらかじめ入れておく)に組織を包埋してからも軽く、OCTと組織の周りのスクロースをなじませるようにピンセットでOCTをかきまぜます。. 逆に脱水が長すぎるのでしょうか? 使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。 12月15日 20:47, [13]  伸展版にのせておくと花開くように 生物学 - 凍結切片に泡 マウスの胚(E11.5)の凍結切片の作製を行なっているのですが、顕微鏡で観察すると組織のところに泡が入っていて泡のある部分の組織が崩れたり、抜けてしまっています。包埋の条件は.. 質問No.2343102  組織のなかに(スライドグラスと切片の間に) お願いします。, 脳の凍結切片を作成して免疫染色を行ったのですが、切片に細かな穴がたくさん開いていて見栄えがとても悪いです。どこが悪かったのでしょうか? 現行のプロトコルは以下になります。 原形を保ったままきちんとスライドグラスに  泡ぶくというか水泡のような盛りあがり PFA…ナカライの電顕用粉末 組織切片ISH(トリ胚網膜、opsin 5、青い点状のシグナルがmRNA発現細胞、右はセンスプローブによる陰性コントロール) 発色基質:NBT, BCIP. mixiユーザー 11月17日 11:24, [10] PBSに量った粉末を入れ、10N NaOH添加し60℃で溶解した後、氷冷、フィルターろ過して、15mlファルコンチューブに分注・-25℃保存したものを使用直前に溶かして固定液として使ってます。pH7.2にしてます。, こんにちは、いつもお世話になってます(^_^) 伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。 ↓Xylene×3 各3hr 11月16日 23:00, [5] ↓PBSでwash (1)伸展版にスライドグラスを置いて 担当編集委員:大隅 典子(東北大学 大学院医学系研究科 附属創生応用医学研究センター 脳神経科学コアセンター 発生発達神経科学分野), 英:in situ hybridization 独:In situ-Hybridisierung 仏:hybridation in situ, In situとは”原位置で”という意味で、in situハイブリダイゼーション(in situ hybridization: ISH)とは原位置でのハイブリダイゼーション(後述)ということである。ISH法には、染色体ISHと組織切片ISH、ホールマウントISH (whole-mount ISH: WISH) がある[1][2]。染色体ISH法は、染色体における目的遺伝子の遺伝子座を明らかにし、染色体異常を検出することができる。組織ISH法は、組織切片を用いて遺伝子発現の第一段階であるmRNAの局在を細胞レベルで明らかにする。病理組織からウイルスゲノムを検出し、ウイルス感染の診断に用いられることもある。また、胚や器官の一部などを丸ごと用いるISH法を、ホールマウントISH(WISH)という。実験例を図1に示す。遺伝子発現部位の三次元的な情報を得た後で、細胞レベルで遺伝子発現部位を同定しなければならない場合は、WISH後の胚などの組織切片を作製する。図2に、組織切片を用いたin situハイブリダイゼーション法の工程を模式的に示す。ISHは、細胞内mRNAの局在を明らかにする実験であるので、分解されやすいRNAをいかに分解させずに実験を行うかが重要である。, ISH法では細胞が死んだ状態でmRNAを検出する。細胞が死んでしまうと、mRNAは急速に分解され消滅してしまう。そのため、in situハイブリダイゼーション法を用いる場合は、細胞内のmRNAの分解を防ぎ、できるだけ生きていた状態を維持しておく必要がある。細胞や組織などをなるべく自然の状態に保存することを固定とよんでいるが、in situハイブリダイゼーション法の場合はmRNAの固定が非常に重要である。In situハイブリダイゼーション法では、用時調製した4%パラホルムアルデヒド液を用いて還流固定し、臓器等を取り出して短時間、低温でさらに浸漬固定することが多い。新鮮迅速凍結切片を用いてISHを行うこともある。組織切片はスライドガラスに貼付けたもの、あるいは浮遊切片[3]を用いる。, 組織ISH法、WISH法のいずれにおいても、ハイブリダイゼーションを行う前に固定した組織の前処理を行う。主な目的は、界面活性剤で細胞膜の透過性を上げ、タンパク質分解酵素proteinase Kなどを用いて結合組織等を分解しプローブの浸透性をよくすることと、プローブの非特異的な吸着を防ぐことである。特に、タンパク質分解酵素の濃度と処理時間は、組織の種類、固定法とも関連し、in situハイブリダイゼーション法の結果を左右する重要な因子である。, 目的のmRNAを検出するために、そのmRNAと特異的にハイブリダイズする、つまり、目的のmRNAと相補的な配列をもったRNAまたはDNAプローブが必要である。プローブとして、, の3種類がよく用いられている。DNAオリゴプローブは、DNA合成装置で合成する。B, Cにおいては、プローブ合成のための鋳型DNAが必要である。RNA-RNAハイブリッドが3者の中で最も安定であり、現在RNAプローブを用いる方法が一般的である。合成したRNAが分解されないように細心の注意を払う。他にlocked nucleic acid (LNA)(後述)やペプチド核酸をプローブとして用いる方法がある。プローブを可視化のために標識する方法には主に次の2つの方法がある。, DNAの二重らせん構造は、塩基対A:Tに形成される2つの水素結合と塩基対G:Cに形成される3つの水素結合により安定に保たれている。この二本鎖を一本鎖にする方法の1つとして、熱変性がある。二重らせんDNA溶液の温度を高くしながら、DNA溶液の260 nmの吸光度A260を測定すると、しだいにA260は高くなる。これはDNAの二重らせんが壊れ、一本鎖になるためで、この温度による吸光度の変化を表す曲線をDNAの融解曲線とよんでいる。この現象は、らせんが消失して塩基間の相互作用が少なくなるため、塩基の光吸収の効率が変化し(深色効果)、各塩基の分子吸光係数が高くなるために生じる。温度の低い時のDNAをヘリックス100%とし、高温での吸光度が一定になる状態でヘリックス0%と仮定すると、ヘリックス50%になる温度(融解温度 (melting temperature: Tm))を決定することができる。, Tmは二重らせんの安定度の目安になる。非常に安定ならせんであれば、Tmは80〜90℃になる。逆に不安定であれば、30〜40℃になる。TmはGC塩基対の含量、核酸の長さ、核酸の塩基対のミスマッチなどに依存し、DNA溶液のイオン強度(塩濃度)や組成により変化する。Tmに関する経験的な式は、例えば、RNA-RNAハイブリッドの場合、, Tm=79.8+18.5(logM)+0.584(%G+C)+0.118 × 10-2(%G+C)2−0.35(%formamide)− 820/l, ここで、Mは1価の正イオンのモル濃度、%G+CはGC含量、%formamideはホルムアミド濃度、lはプローブの長さ(bp)である。, Tmの温度では、全体の50%ほど二重らせんが形成されていることになる。ハイブリダイゼーションの温度Thは、Tmより5〜20℃低い温度で行う。どの程度まで塩基対のマッチを許容するかをstringencyとよぶ。例えば、(Tm−5)℃でハイブリダイズさせると、stringencyが非常に高くなり、完全マッチした安定なDNA-DNAしかハイブリッドを形成しない。しかし、ハイブリダイズする温度を(Tm−20)℃と低下させ、stringencyを低くすると、ミスマッチをもったハイブリッドが形成される可能性が高くなる。, DIGを用いた組織in situハイブリダイゼーション法では、1kb程度のRNAプローブ(GC含量約50%)を使用する場合、50%ホルムアミド中65℃、12〜14時間で、ほぼよい結果が得られる。もし、短いRNAやGC含量の低いRNAをプローブとする場合は、低stringencyの条件でハイブリダイゼーションを行う。プローブの濃度も重要であり、濃度の高いほうが再会合率が高くなる。プローブの長さが大きいほどシグナルが強くなるが、プローブの配列によってはハイブリダイゼーションに交差性を認める結果となる場合もある。2kbをこえるとアルカリ加水分解によってRNAの長さを小さくし、組織への浸透を高めるようにする。, 非特異的に結合したプローブを除去するために、組織を洗浄する.洗浄の条件を厳しくするとバックグラウンドが低下するが、同時にシグナルも弱くなる。RNA-RNAハイブリットは通常のRNA分解酵素 (RNAse)では分解されないので、これ以降の実験工程はRNAseフリーでなくてよい。, 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う.プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase: AP)または西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase: HRP)などの酵素が結合(conjugate)している.例えば、抗体に結合されたAPの基質として、5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt (BCIP)およびnitro-blue tetrazolium chloride (NBT)を用いた場合は、APがBCIPを脱リン酸化し、中間産物が遊離すると発色する(図3)。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。, 放射性同位元素(RI)として35S標識された核酸を用いてプローブを合成する。写真用フイルムまたはオートラジオグラフィー用の乳剤を用いてRIの放出するβ線を検出する。, 組織切片の場合、色素で対比染色し形態学的な観察を容易にする。結果を顕微鏡で観察し、さらに写真や画像として記録する。, 発色法では、アルカリフォスファターゼ (AP) の基質を変えることにより、2つの遺伝子の発現を同時に検出できる。すなわち、調べたい2つの遺伝子のRNAプローブをDIGまたはフルオレセインで標識し、混合プローブでハイブリダイゼーションさせる。まずAP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、洗浄、発色まで行う(基質はFast Red)。その後、酸処理(0.1Mグリシン-HCl、pH2.2)および後固定を行って1色めのアルカリフォスファターゼを失活させる。その後、AP標識抗DIG抗体で反応させ、洗浄、発色を行う(基質NBT/BCIP)。または、DIGまたはフルオレセインで標識した2つのRNAプローブでハイブリダイゼーションさせて洗浄、HRP標識抗DIG抗体で反応させ、HRPの基質ジアミノベンジジン(Diaminobenzidine: DAB)を用いてまず発色させる。次に、AP標識抗フルオレセイン抗体で反応させ、その後APの基質(NBT, BCIP)を用いて発色させる。, 蛍光ISH法では、HRP標識の抗体に対して、tyramideを結合させた低分子(ビオチンやフルオレセインなど)を反応させシグナルを増強させる方法 (tyramide signal amplification: TSA) を用いる。すなわちtyramideは、ペルオキシダーゼ活性によってラジカル化し組織(タンパク質のTyr, Trp残基など)に低分子ごと集積する。集積した低分子を、蛍光物質の場合はそのまま蛍光顕微鏡等で検出でき、そうでなければその低分子に対する蛍光標識抗体またはストレプトアビジンを反応させて間接的に検出することもできる。細胞レベルでmRNAの共在性を証明するためには蛍光ISH法は必須であり、AP反応系Fast Red/HNPPと組み合わせることで2重蛍光ISH法を行うことができる。抗体染色との2重染色では、以上のISH工程をタンパク質分解酵素なしで行ってそのあと通常の間接蛍光抗体染色を行う、あるいは先にビオチン化抗体と蛍光標識アビジンを用いてRNAseフリーで抗体染色を行い、その後AP反応系Fast Red/HNPPによるISH法を行うなどの方法がある。さらなる多重蛍光ISH法については、hybridization chain reaction法がある。, Locked nucleic acid (LNA)プローブを用いる。LNAは、リボ核酸の2’位の酸素原子と4’位の炭素原子とが架橋しており、相補的な核酸に対合したときの熱安定性が非常に高く、短いRNAに対して高いTm値でハイブリダイゼーションできる。この性質を利用してLNAプローブによりマイクロRNAのISHが可能になった。, Allen Brain Atlasは、マイクロソフト社創設者の一人であるPaul G. Allenの出資によって2003年に設立されたAllen Institute for Brain ScienceのISHデータベースである。2006年12月発表のNature の記事によると、まず約2万の遺伝子のマウス成体脳における組織切片ISHのデータが公開された[4]。現在、マウス脳に加えて、ヒト脳、発生期マウス脳、発生期ヒト脳、マウス脳神経回路、ヒト以外の霊長類脳、マウス脊髄、ヒト神経膠芽腫に関するISHデータベースが公開されている。, Perkin-Elmer社のチラミドを用いたISHとシグナル増強(CARD)の説明。, コスモバイオ社のマイクロRNAのISH (locked nucleic acid)の説明。, https://bsd.neuroinf.jp/w/index.php?title=In_situハイブリダイゼーション法&oldid=35424, Attribution-NoDerivatives 4.0 International.